在與蛋白相關(guān)的檢測(cè)中，zui關(guān)鍵的一步便是蛋白質(zhì)的提取。在提取的過(guò)程中，我們要經(jīng)常加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)的降解。另外在磷酸化蛋白的研究過(guò)程中，磷酸酶抑制劑也是*的。
本文詳細(xì)總結(jié)了常用的蛋白酶抑制劑PMSF、Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin胃蛋白酶抑制劑、EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制劑NaF氟化鈉、Na3VO4原礬酸鈉、Beta-glycerophosphate甘油磷酸鈉、Na2P2O4焦磷酸鈉等的溶液配制、貯存液與工作液濃度及保存條件。
一、蛋白酶抑制劑
PMSF：
特性：絲氨酸蛋白酶抑制劑，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于異丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。在水溶液中不穩(wěn)定。在100%異丙醇，25℃時(shí)穩(wěn)定至少9個(gè)月。
分子量：174.2
使用：貯存濃度200mM，工作濃度1mM
Leupeptin 亮肽素
特性：抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖溶酶和組織蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。4℃一周穩(wěn)定，分成小份，冷凍在-20℃至少6個(gè)月。
分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6
使用：貯存濃度1mg/ml，工作濃度0.5 ug/ml (1mM)。
Aprotinin抑肽酶
特性：絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X(jué)。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或緩沖液（例如0.1M tris，pH8.0）。pH約7~8的溶液在4℃可保存1周，分裝保存在-20℃可至少保存6個(gè)月。避免反復(fù)凍融, pH>12.8的堿性環(huán)境可使其滅活。
分子量：6,512
使用：貯存濃度1mg/ml，工作濃度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
Pepstatin胃蛋白酶抑制劑
特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、腎素、組織蛋白酶D、凝乳酶、許多微生物酸性蛋白酶
溶解性：溶于甲醇約1mg/ml； 可溶于乙醇，第二天溶解可達(dá)到1 mg/ml；在6當(dāng)量乙酸中溶解度為300ug/ml。4℃穩(wěn)定一周，分裝儲(chǔ)存于-20℃時(shí)可保存1個(gè)月。
分子量：685.9
使用：貯存濃度1mg/ml，使用濃度0.7 μg/ml(1 μM)。
EDTA-Na2
特性：金屬蛋白酶抑制劑
溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的條件下，4℃穩(wěn)定至少6個(gè)月
分子量：372.24
使用：工作濃度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需現(xiàn)用現(xiàn)配，在溶液pH值調(diào)至8~9時(shí)再加入。
二、磷酸酶抑制劑
NaF氟化鈉
溶解性：溶于水
分子量：41.99
使用：貯存液5M，工作濃度10~20mM。
Na3VO4 原礬酸鈉
分子量：183.91
溶解性：溶于水，我們購(gòu)買(mǎi)過(guò)來(lái)的是原礬酸鈉。原礬酸鈉需要經(jīng)過(guò)處理以后才能成為激活的礬酸鈉，激活的礬酸鈉才具有抑制去磷酸化的作用。原礬酸鈉變成激活的礬酸鈉的過(guò)程是：100mM原礬酸鈉激活儲(chǔ)存液配制
(1). 取0.183克的原礬酸鈉溶解于10ml的雙蒸水中，加酸調(diào)節(jié)PH至10(顏色變黃)。
(2). 煮至無(wú)色
(3). 室溫冷卻
(4). 重調(diào)pH至10
(5). 重復(fù)(1)(2)(3)(4)直至溶液保持無(wú)色，并且pH穩(wěn)定于10，分裝100ul/管，每10ml裂解液加一管。
使用：貯存液100mM， 工作濃度1mM，-20度保存。
Beta-glycerophosphate 甘油磷酸鈉
溶解性：溶于水
分子量：306.11
使用：貯存液100mM，工作濃度25mM。
Na2P2O4 焦磷酸鈉
溶解性：溶于水
分子量：265.9
使用：貯存液100mM，工作濃度1-2 mM。
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